곰팡이 β에 대한 구조적 및 기계적 통찰력

Nature 616권, 190~198페이지(2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

막 통합 합성효소 FKS는 곰팡이 세포벽의 핵심 구성 요소인 β-1,3-글루칸의 생합성에 관여합니다1,2. FKS는 에키노칸딘(echinocandin)과 ibrexafungerp3,4를 포함하여 널리 처방되는 항진균제의 표적입니다. 불행하게도 FKS의 작용 메커니즘은 여전히 ​​수수께끼로 남아 있으며 이로 인해 해당 효소를 표적으로 하는 보다 효과적인 의약품 개발이 방해를 받고 있습니다. 여기에서는 Saccharomyces cerevisiae FKS1과 에키노칸딘 내성 돌연변이 FKS1(S643P)의 저온 전자 현미경 구조를 제시합니다. 이러한 구조는 막-세포질 경계면에서 효소의 활성 부위와 막 이중층에 걸쳐 있는 글루칸 전위 경로를 나타냅니다. FKS1 구조에서 다중 결합 지질과 주목할만한 막 왜곡이 관찰되어 활성 FKS1-막 상호 작용을 암시합니다. Echinocandin 내성 돌연변이는 FKS1의 TM5-6 및 TM8 근처 지역에 모여 있습니다. FKS1(S643P)의 구조는 이 영역의 변경된 지질 배열을 보여 주며, 이는 돌연변이 효소의 약물 저항성 메커니즘을 암시합니다. 본 연구에서 밝혀진 FKS1의 약물 내성 돌연변이에 대한 구조, 촉매 메커니즘 및 분자적 통찰력은 곰팡이 β-1,3-글루칸 생합성에 대한 기계적 이해를 향상시키고 FKS를 표적으로 삼아 새로운 항진균제 개발을 위한 기반을 마련합니다.

침습성 진균 감염으로 인해 매년 150만 명이 넘는 사망자가 발생하며 공중 보건에 심각한 위협이 됩니다5. 이러한 감염은 면역력이 저하된 인구뿐만 아니라 코로나19 환자에게도 상당한 우려 사항(예: 높은 사망률 유발)입니다(참고 5,6)(https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html). ). 제한된 종류의 항진균제와 최근 다제내성 칸디다 아우리스(Candida auris)의 발생과 같은 새로운 약물 내성 균주로 인해 감염된 환자를 치료하는 데 심각한 어려움이 발생했습니다7,8. 따라서 새로운 항진균제 개발의 필요성이 시급하다8.

β-1,3-글루칸은 곰팡이 세포벽의 기본 구성 요소이므로 생합성을 목표로 하는 것은 광범위한 항진균제 개발을 위한 중요한 전략입니다3,9. 곰팡이 세포벽의 β-1,3-글루칸은 GTPase Rho1에 의해 조절되는 막 통합 신타제 FKS10,11에 의해 합성됩니다(참조 12,13). FKS는 기증자 UDP-포도당에서 β-1,3-글리코시드 결합을 통해 성장하는 글루칸 사슬로 포도당을 전달하고 중합된 β-1,3-글루칸을 세포외 공간으로 이동시킵니다(그림 1a). FKS 상동체는 분석된 모든 곰팡이에서 확인되었으며 많은 주요 곰팡이 병원체의 생존에 필수적입니다. Candida glabrata와 S. cerevisiae에서 FKS1과 FKS2의 동시 파괴는 치명적인 표현형을 보여주었습니다. Candida albicans 및 Cryptococcus neoformans의 FKS1은 생존 가능성에 필수적입니다. FKS1 결실이 있는 곰팡이 Aspergillus fumigatus는 심각한 성장 결함과 세포 용해로 고통받습니다. 현재 FKS를 표적으로 하는 잘 알려진 두 가지 항진균제가 시중에 나와 있습니다. 임상 실습에서 널리 사용되는 1차 항진균제인 에키노칸딘과 새로 승인된 경구용 살균제인 ibrexafungerp입니다4. FKS 기능을 표적으로 하는 더 많은 새로운 약물(예: rezafungin)이 후기 단계 임상 시험에 진입하고 있습니다4. 불행하게도 FKS 돌연변이는 침습성 진균 감염에서 새로운 우려 사항인 에키노칸딘 내성 및 치료 실패와 밀접하게 연관되어 있습니다. 임상적으로 확인된 수많은 에키노칸딘 내성 돌연변이가 FKS20,22의 3개 보존 영역에 집중되어 있습니다. 단일 FKS 대립유전자의 돌연변이는 에키노칸딘에 내성을 갖는 곰팡이 균주를 만드는 데 충분합니다.

a, 곰팡이 세포벽 모델. FKS1은 UDP-Glc를 사용하여 β-1,3-글루칸을 합성합니다. 패널 a의 그래픽은 BioRender(https://biorender.com)를 사용하여 생성되었습니다. b, FKS2 억제제 FK506이 있거나 없는 FKS1-KO(KO) 균주와 WT 균주의 성장을 조사하여 FKS1의 생체 내 분석. 데이터는 평균 ± sem입니다. n = 3개의 독립적인 실험. c, UDP-Glc, Rho1, GTPγS 및 항진균제(caspofungin(CFN) 및 micafungin(MCF))과 같은 다양한 효과기를 갖는 CHAPS 정제 FKS1의 시험관 내 활성. 활동은 생성된 UDP를 모니터링하여 측정되었습니다. 데이터는 평균 ± sem입니다. n = 3개의 독립적인 실험. d, e, GDN 정제 FKS1(S643P)에 의해 합성된 수불용성 고분자의 효소적 소화. 특정 엔도-1,3-β-글루카나아제와 엔도-1,4-β-글루카나아제가 사용되었습니다. 이 실험은 비슷한 결과로 세 번 반복되었습니다. 지정된 시간에 회수되고 박층 크로마토그래피 분석(e)을 거친 d의 폴리머 소화(d) 및 가수분해 샘플의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 포도당(G1), 라미나리비오스(G2), 라미나리트리오스(G3) 및 라미나리헥사오스(G6)를 표준물질(레인 M)로 사용했습니다. f, GDN 정제 FKS1(S643P)에 의해 합성된 중합체의 글리코실 결합(메틸화) 분석. 합성된 중합체로부터 유래된 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트의 가스 크로마토그램 프로파일이 표시됩니다. 주요 피크(녹색 점선 상자로 표시)는 질량 분석법으로 확인된 1,3-Glcp 연결을 나타냅니다(확장 데이터 그림 2d). g, FKS1의 도메인 구성 도식. h, FKS1의 Cryo-EM 맵, 멤브레인과 평행하게 보입니다. 지도는 연한 노란색의 지질 유사 밀도와 함께 g로 표시되는 네 부분으로 구분됩니다. i, 만화 디스플레이에서 FKS1 구조의 두 직교 뷰. FKS1의 네 부분은 g와 같이 색상이 지정됩니다. j, TM 도메인이 숨겨진 세포질 영역의 세포 내 모습. FKS1 GT 도메인의 중앙 β 시트는 표시된 대로 β3-β11로 구성됩니다. 점선은 무질서한 영역을 나타냅니다.