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Nature Communications 13권, 기사 번호: 4906(2022) 이 기사 인용

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활성화된 에스테르 또는 페녹시 라디칼을 기반으로 하는 효소 기반 근접 라벨링 접근법은 살아있는 세포에서 세포내 프로테옴 및 단백질 상호작용자를 매핑하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 그러나 활성화된 에스테르는 반응성이 낮아 라벨링 반경이 넓어지고 과산화물 처리로 생성된 페녹시 라디칼은 산화환원 민감 경로를 방해할 수 있습니다. 본 명세서에서는 감광제 단백질 miniSOG를 관심 있는 단백질에 유전적으로 부착하여 설계된 광활성화 종속 근접 라벨링(PDPL) 방법을 보고합니다. 청색광에 의해 유발되고 조사 시간에 따라 조정되면 일중항 산소가 생성된 후 히스티딘 잔기의 시공간적으로 해결된 아닐린 프로브 라벨링이 가능해집니다. 우리는 세포소기관 특이적 프로테옴의 매핑을 통해 그 높은 충실도를 보여줍니다. PDPL과 TurboID를 나란히 비교하면 PDPL의 더 구체적이고 더 깊은 단백질체학 적용 범위가 드러납니다. 우리는 질병 관련 전사 보조 활성 인자인 BRD4 및 E3 리가제 Parkin에 PDPL을 추가로 적용하고 이전에 알려지지 않은 상호작용자를 발견합니다. 과발현 스크리닝을 통해 두 개의 보고되지 않은 기질인 Ssu72와 SNW1이 Parkin에 대해 확인되었으며, Parkin의 분해 과정은 유비퀴틴화-프로테오솜 경로에 의해 매개됩니다.

단백질 네트워크의 정확한 특성 분석은 많은 근본적인 세포 과정을 뒷받침합니다1. 따라서, 단백질 상호작용의 고충실도 시공간 매핑은 생물학적 경로, 질병 병리를 해독하기 위한 분자적 기반을 제공할 뿐만 아니라 치료 목적으로 이러한 상호작용을 교란할 수 있는 가능성을 제공합니다2. 이를 위해서는 살아있는 세포나 조직에서 일시적인 상호작용을 감지할 수 있는 방법이 절실히 필요합니다. 친화도 정제-질량 분석법(AP-MS)은 역사적으로 관심 단백질(POI)의 결합 파트너를 끌어내는 데 사용되었습니다. 정량적 단백질체학 접근법의 발전으로 AP-MS 기반의 최대 단백질 네트워크 데이터베이스 Bioplex3.0이 구축되었습니다3. AP-MS는 매우 강력하지만 워크플로의 세포 용해 및 희석 단계는 약하고 일시적인 결합 상호 작용에 대한 편향을 가지며 용해 이전에 구획화가 부족한 의사 상호 작용 쌍과 같은 용해 후 인공물을 도입합니다4.

이러한 문제를 해결하기 위해 가교 그룹과 효소 근접 라벨링(PL) 플랫폼(예: APEX 및 BioID)이 있는 비천연 아미노산(UAA)이 개발되었습니다5. UAA 방법은 많은 시나리오에 성공적으로 적용되었으며 직접 단백질 바인더에 대한 정보를 제공하지만 여전히 UAA 삽입 사이트의 최적화가 필요합니다. 더 중요한 것은 라벨링 이벤트의 촉매 회전율이 부족한 화학양론적 라벨링 방법입니다. 반대로, BioID 방법과 같은 효소적 PL 방법은 조작된 비오틴 리가제를 POI7에 융합시킨 후 비오틴을 활성화하여 반응성 에스테르 비오티노일-AMP 중간체를 생성합니다. 따라서 이 효소는 근위 라이신 잔기에 태그를 붙이는 활성화된 비오틴의 "구름"을 촉매하고 방출합니다. 그러나 BioID는 충분한 라벨링 신호를 얻기 위해 12시간 이상이 필요하므로 일시적으로 해결되는 방식으로 적용할 수 없습니다. 효모 디스플레이 기반 유도 진화를 사용하여 TurboID는 BioID에서 훨씬 더 높은 효율성으로 설계되어 10분 이내에 효과적인 비오틴 라벨링을 달성하여 보다 역동적인 프로세스를 연구할 수 있게 되었습니다. TurboID는 활성도가 높고 내인성 비오틴 수준이 낮은 수준 라벨링에 충분하므로 외인성 비오틴 추가를 통해 강력하게 향상되고 시간 조절 라벨링이 필요할 때 배경 라벨링이 잠재적인 문제가 됩니다. 더욱이, 활성화된 에스테르 종은 반응성이 좋지 않아(t1/2 ~5분), 특히 비오틴으로 이웃 단백질이 포화된 후에 넓은 라벨링 반경으로 이어질 수 있습니다5. 다른 접근법에서는 조작된 아스코르브산 퍼옥시다제(즉, APEX)의 유전적 융합이 H2O2로 활성화 시 비오틴-페놀 라디칼을 생성하고 1분 이내에 단백질 라벨링을 달성합니다9,10. APEX는 세포내 단백질체, 막 단백질 복합체 및 세포질 신호 전달 단백질 복합체를 식별하는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 고농도의 과산화물에 대한 요구 사항은 산화 환원에 민감한 단백질이나 경로에 영향을 미쳐 세포 과정을 교란시킬 수 있습니다.

8-fold increase in signal for probe 3, while probe 2 used in the RNA-labeling method CAP-seq only displaying ~2.5-fold signal increase, likely due to different reactivity preferences between RNA and protein (Fig. 1b, c). Furthermore, the isomers of probe 3 and hydrazine probe (probe 5, 6, 7) were also tested, confirming probe 3 as the optimized one (Supplementary Fig. 1b, c). Likewise, in-gel fluorescence analysis determined other optimized experimental parameters: illumination wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), and illumination time (20 min) (Supplementary Fig. 2a–c). Omission of any component or step in the PDPL protocol resulted in significant reversion of signal-to-background (Fig. 1d). Notably, protein labeling was greatly reduced in the presence of sodium azide or trolox, which are known to quench singlet oxygen28. The presence of D2O, known to stabilize singlet oxygen, enhanced the labeling signal. To investigate the contribution of other reactive oxygen species to labeling, mannitol and vitamin C, established hydroxyl radical and superoxide radical scavengers respectively18,29, were added but not found to reduce labeling. The addition of H2O2 rather than illumination failed to generate labeling (Supplementary Fig. 3a). Fluorescent imaging of singlet oxygen by Si-DMA probe confirmed the presence of singlet oxygen in the HEK293T-miniSOG line, but not the parental HEK293T line. In addition, mitoSOX Red was unable to detect superoxide generation after illumination (Fig. 1e and Supplementary Fig. 3b)30. These data strongly indicate singlet oxygen as the major ROS that gives rise to subsequent proteome labeling. The cytotoxicity of PDPL, including the blue light illumination and chemical probe treatment, was evaluated, and no significant cytotoxicity was observed (Supplementary Fig. 4a)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. e Specificity analysis for proteomic data sets derived from experiments in d. Total numbers of statistically significant proteins in each organelle (red and green dots) were labeled on top. Bars show organelle-localized proteins based on MitoCarta 3.0, GO analysis, and A. Ting et. al. dataset for mitochondrial, nucleus, and ER, respectively. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>2-fold ion intensity) as well as singleton proteins that are only present in miniSOG-expressing lines (Fig. 3d red and green dots). Combining these data, we identified 1364, 461, and 911 statistically significant proteins for the nucleus, mitochondria, and ER outer membrane, respectively. To analyze the accuracy of organelle-localized PDPL, we used MitoCarta 3.0, Gene ontology (GO) analysis, and the A. Ting et al. dataset8 for mitochondria, nucleus, and ER to validate the organelle-specificity of detected proteins, which corresponded to 73.4, 78.5, and 73.0% accuracy (Fig. 3e). The specificity of PDPL validates that PDPL is an ideal tool for identifying organelle-specific proteomes. Notably, submitochondrial analysis of the identified mitochondrial proteins revealed that the captured proteome was mainly distributed in the matrix and inner membrane (226 and 106, respectively), accounting for 91.7% of the total identified mitochondrial proteins (362), which further confirmed the high-fidelity of PDPL (Supplementary Fig. 7a). Likewise, the subnuclear analysis revealed the captured proteome was predominantly distributed in the nucleus, nucleoplasm, and nucleolus (Supplementary Fig. 7b). Nucleus proteome profiling by nuclear localization signals (3xNLS) peptide revealed similar accuracy to H2B construct (Supplementary Fig. 7c–h). To define the labeling specificity of PDPL, nuclear Lamin A was selected as a more discretely localized POI bait7. PDPL identified 36 significantly enriched proteins, with 12 proteins (30.0%, including Lamin A) being well-characterized Lamin A interacting proteins annotated by the String database, representing a higher percentage than the BioID method (28 out of 122 proteins, 22.9%)7. Our method identified less proteins, likely due to the restricted labeling area, enabled by more reactive singlet oxygen. GO analysis reveals that the identified proteins are mainly located in the nucleoplasm (26), nuclear envelope (10), nuclear membrane (9), and nuclear pore (5). Combined, these nucleus-localized proteins account for 80% of the enriched proteins, further demonstrating the specificity of PDPL (Supplementary Fig. 8a–d)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. b Venn diagram showing overlapping proteins between N-terminal and C-terminal constructs. N-terminal tagging can aberrantly activate Parkin and lead to more identified proteins. c Venn diagram showing overlapping proteins between PDPL and AP-MS. Known interactors are listed, including four proteins out of 18 overlapped proteins, as well as 11 proteins out of 159 exclusively identified in PDPL. d Representative targets identified by LC-MS/MS were validated using Western blot. e Ssu72 and SNW1 were identified as unreported substrates of Parkin. Plasmids with these proteins labeled with FLAG were transfected into HEK293T and HEK293T-Parkin-miniSOG, followed by CCCP treatment across different time points. The degradation is more significant in the Parkin overexpressing line. f The Ssu72 and SNW1 degradation process was confirmed to be mediated by the ubiquitination-proteasome pathway by using the proteasome inhibitor MG132. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>2 (unless otherwise stated) and p value <0.05. Protein interaction analysis was performed using GO analysis as well as the String database./p>